MTT assay

Apa itu MTT assay?

MTT assay merupakan metode yang jamak digunakan dalam penelitian mengenai agen antikanker. Metode ini digunakan untuk menguji aktivitas sitotoksik sampel penelitian pada kultur sel yang digunakan.

Bagaimana prinsip MTT assay?

Prinsip metode ini adalah reaksi redoks yang terjadi di dalam sel. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) direduksi menjadi garam formazan oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di dalam mitokondria sel hidup. Reaksi dibiarkan terjadi selama 4 jam kemudian ditambahkan reagen stopper. Reagen stopper tersebut akan melisis membran sel sehingga garam formazan dapat keluar dari sel, serta melarutkan garam formazan tersebut. Garam formazan yang terbentuk dikuantifikasi dengan spektrofotometer dan diukur dalam bentuk absorbansi. Semakin tinggi absorbansi, semakin banyak sel yang hidup (viabilitas sel tinggi)

Bagaimana reaksi yang terjadi dalam sel?

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003450912001447

Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, MTT akan direduksi oleh enzim dehidrogenase (merupakan suatu enzim oksidoreduktase, karena terlibat dalam reaksi redoks) yang terdapat dalam mitokondria sel hidup, menjadi garam formazan. Enzim suksinat dehidrogenase ini merupakan enzim yang terlibat dalam respirasi sel, yaitu dalam siklus krebs. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan enzim yang mengubah suksinat menjadi fumarat.

Apa saja zat yang dapat digunakan sebagai reagen stopper?

Zat yang dapat digunakan sebagai reagen stopper adalah surfaktan. Hal ini dimaksudkan agar zat tersebut dapat melisis membran sel serta melarutkan kristal formazan yang sebenarnya tidak larut dalam media kultur. Terdapat beberapa jenis zat yang dapat digunakan, antara lain SDS dalam HCl, isopropanol, dan DMSO.

Apa titik krusial dalam melakukan MTT assay?

1. Penanaman sel dalam 96 well plate

Untuk 1 konsentrasi sampel, digunakan triplo well (3 well) untuk mendapatkan validitas penelitian. Oleh karena itu, penanaman sel dilakukan dengan memasukkan 4 triplo terlebih dahulu berurutan, kemudian wadah berisi kultur sel disuspensikan kembali, dan ditanam lagi 4 triplo berikutnya. Hal ini dilakukan agar jumlah sel di setiap triplo seragam sehingga menghindari deviasi data yang besar.

2. Pengamatan sel sebelum dilakukan treatment menggunakan sampel

Sebelum dilakukan treatment menggunakan sampel, lihat sel terlebih dahulu dan pastikan kepadatan sel dalam tiap well sekitar 70-80% (konfluen). Jika terlalu rendah, dikhawatirkan seluruh sel akan mati akibat perlakuan sampel bahkan dalam konsentrasi rendah sehingga absorbansi yang didapatkan tidak valid. Sementara jika terlalu padat, jumlah sel dalam well kontrol sel akan terlalu padat.

3. Selalu memastikan wadah berisi MTT kedap cahaya

MTT merupakan zat yang peka terhadap cahaya sehingga harus selalu terlindung dari cahaya (dapat menggunakan alumunium foil untuk membungkus wadahnya), walaupun sudah diencerkan menggunakan media kultur.

4. Garam formazan yang terbentuk harus benar-benar larut

sebelum dibaca menggunakan elisa reader, pastikan garam formazan yang terbentuk telah larut sempuran (tidak ada kristal lagi di dalam well). Hal ini dikarenakan adanya kristal akan mempengaruhi pembacaan larutan oleh spektrofotometer sehingga absorbansi yang didapatkan tidak valid. Pelarutan garam formazan ini sangat ditentukan oleh ketepatan komposisi reagen stopper serta dapat dibantu pelarutannya menggunakan shaker.

intensitas warna ungu ditentukan oleh sel yang hidup, semakin intens warna ungu, semakin tinggi jumlah sel yang hidup

Protokol untuk melakukan MTT assay dapat dilihat di : http://www.ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.-Sitotoksik.pdf

Advertisements

2 thoughts on “MTT assay

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s