molecular biology · my labwork · publication

Identifikasi Protein dengan MALDI-TOF MS (1)

Beberapa waktu yang lalu, saya dikontak oleh beberapa orang untuk berdiskusi mengenai prosedur identifikasi protein. Saya jadi kepikiran untuk sedikit cerita suka-duka yang saya alami dalam melakukan eksperimen identifikasi protein. Kebetulan, saya sedikit belajar tentang identifikasi protein ketika sekolah S2 dan hasil penelitian tersebut dipublikasikan di sini. Dalam penelitian tersebut, saya meneliti tentang protein yang berinteraksi secara spesifik dengan kurkumin, dengan menggunakan model sel leukemia (chronic myeloid leukemia/CML).

Secara umum, eksperimen identifikasi protein dibagi menjadi 3 tahap, yaitu preparasi sampel, aplikasi sampel ke dalam instrumen, dan analisis data yang dihasilkan oleh instrumen tersebut. Instrumen yang lazim digunakan untuk identifikasi protein adalah mass spectrometry. Terdapat berbagai jenis mass spectometry; dan instrumen yang saya gunakan adalah MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry). Prinsip kerja MALDI-TOF akan saya jabarkan di bawah.

Tahapan eksperimen yang saya lakukan sendiri adalah preparasi sampel dan analisis data, sementara tahap aplikasi sampel ke dalam instrumen MALDI-TOF dilakukan oleh teknisi khusus alat MALDI-TOF di kampus karena pengoperasian alat ini memerlukan skill dan lisensi khusus. Oleh karena itu, saya akan membahas lebih detail bagian preparasi sampel dan analisis data.

  1. Preparasi sampel

Identifikasi protein dengan MALDI-TOF (atau mass-spectometry lainnya) adalah eksperimen yang mahal dan memerlukan effort yang besar. Oleh karena itu, perencanaan eksperimen dan preparasi sampel yang cermat sangat diperlukan sehingga eksperimen memberikan hasil yang memuaskan.

Preparasi sampel yang dilakukan bergantung pada jenis eksperimen dan tujuan data eksperimen tersebut. Karena saya ingin mengetahui interaksi kurkumin dengan protein, maka saya membuat kurkumin beads sebagai bait untuk menarik protein interaktornya dari lisat sel (isolasi protein) dengan metode pulldown assay. Contoh lain, jika kita ingin meneliti interaksi antar protein-protein, maka gunakan salah satu protein sebagai bait-nya. Selain dengan pulldown assay, berbagai metode dapat digunakan untuk mengisolasi protein yang diinginkan, antara lain kromatografi afinitas. Kita juga bisa menggunakan lisat sel keseluruhan (whole cell lysate) sebagai sampel jika ingin mengidentifikasi protein dari suatu sampel sel atau jaringan.

Untitled
Skema kerja isolasi protein yang berinteraksi dengan kurkumin, menggunakan metode pulldown assay

Dua hal mendetail yang tidak banyak dibahas di dalam paper-paper adalah resiko kontaminasi dan pemilihan reagent staining untuk visualisasi protein target. MALDI-TOF dan mass spectrometry lain adalah instrumen-instrumen yang sangat sensitif . Oleh karena itu, besar resiko terjadi kontaminasi dari protein lain ketika kita mengerjakan eksperimen ini. Apa kontaminasi yang terjadi dan dari mana asal kontaminasi tersebut?

Kontaminasi yang sangat mungkin terjadi adalah terdeteksinya protein keratin dalam sampel kita. Suspect terjadinya kontaminasi tersebut adalah diri kita sendiri sebagai pelaku eksperimen karena keratin dapat berasal dari serpihan kulit atau rambut kita. Oleh karena itu, diperlukan kewaspadaan yang tinggi dalam melakukan preparasi sampel untuk identifikasi protein. Tindakan-tindakan yang dapat dilakukan untuk meminimalisir kontaminasi antara lain:

  • Membersihkan peralatan SDS-PAGE dengan baik (merendam peralatan dengan cairan pembersih minimal selama 1 jam, membilas peralatan dengan aquabides sebanyak 2-3 kali, lalu mengeringkan peralatan di dalam oven tanpa adanya peralatan lain)
  • Gunakan 2 lapis sarung tangan selama melakukan eksperimen dan/atau membersihkan peralatan
  • Lakukan eksperimen dengan ringkas dan gerakan seminimal mungkin. Oleh karena itu, penting dilakukan ‘simulasi’ eksperimen untuk mengetahui letak alat, reagen, dan hal lain yang diperlukan. Hal ini akan meminimalisir terjadi gerakan yang tidak perlu ketika eksperimen yang sesungguhnya.

Deteksi awal protein target dilakukan dengan SDS-PAGE dilanjutkan dengan staining gel menggunakan reagent yang sesuai. Pada awal eksperimen (optimasi metode), saya menggunakan metode silver staining untuk visualisasi protein pada gel karena metode ini memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi dengan harga yang relatif terjangkau. Namun, saya tidak dapat menggunakan metode silver staining dalam preparasi sampel untuk instrumen MALDI-TOF karena perlu dilakukan destaining pada gel sebelum sampel dapat diaplikasikan pada instrumen. Perlunya tahap destaining akan memperpanjang eksperimen yang perlu dilakukan dan memperbesar resiko terjadinya kontaminasi protein. Oleh karena itu, saya menggunakan flamingo staining untuk visualisasi gel hasil SDS-PAGE. Kelebihan flamingo staining adalah sifatnya yang kompatibel dengan MALDI-TOF sehingga tidak diperlukan destaining gel sebelum sample diaplikasikan pada instrumen.

Screen Shot 2018-04-20 at 19.30.30
Hasil isolasi protein yang berikatan dengan kurkumin beads dan control beads. Gel yang menunjukkan posisi protein yang diinginkan (<50 kDa) kemudian dipotong dan dianalisis dengan MALDI-TOF MS

Berdasarkan hasil eksperimen SDS-PAGE, saya menemukan bahwa kurkumin berikatan dengan protein-protein dengan ukuran <50 kDa. Oleh karena itu, untuk keperluan analisis MALDI-TOF, saya hanya menganalisis protein dengan ukuran <50 kDA dengan cara memotong gel hasil SDS-PAGE tersebut pada ukuran <50 kDa. Saya juga membandingkan protein yang berikatan pada control beads (beads yang tidak dikopling dengan kurkumin) vs protein yang berikatan pada kurkumin beads untuk mengeliminasi false positive pada hasil analisis MALDI-TOF.

___________________________________________________________________________________________

bersambung ke bagian dua di sini.

 

 

Advertisements
molecular biology · my labwork · publication

Identifikasi Protein dengan MALDI-TOF MS (2)

Baca tahapan eksperimen sebelumnya di sini.

  1. Aplikasi sampel ke dalam instrumen (MALDI TOF)

Tahap eksperimen ini tidak saya lakukan sendiri sehingga saya akan menceritakan secara sederhana prinsip kerja instrumen MALDI-TOF MS. Sampel yang sudah didapat dari tahap sebelumnya (tahap 1) dicampurkan dengan matriks dan kemudian diaplikasikan pada instrumen. Dalam eksperimen saya, sampel protein didigesti terlebih dulu dengan enzim tripsin dan peptida-peptida protein yang terbentuk dicampur dengan matriks. Digesti protein menjadi peptida penting dilakukan karena MALDI-TOF dapat mendeteksi molekul dengan baik pada rentang ukuran 600 Da-3500 Da (0.6 kDa-3.5 kDa). Penjelasan lebih lanjut mengenai matriks MALDI-TOF dapat dibaca di sini.

Sampel dan matriks kemudian ditembak dengan laser dan radiasi laser tersebut akan ‘menguapkan’ dan memberi muatan elektronik pada matriks+sampel hingga menjadi ion, yang kemudian ion tersebut bergerak menuju ke detektor. Besarnya muatan elektronik ion akan memisahkan ion satu dengan yang lain (berdasarkan rasio m/z+ atau rasio massa/muatan elektronik) sehingga akan terbentuk spektra massa yang kemudian dideteksi oleh detektor.

 

malditof
Prinsip kerja instrumen MALDI-TOF MS (sumber)

 

  1. Analisis data

Setelah sampel selesai dianalisis dengan alat MALDI-TOF, saya mendapat raw data dari sampel beads kontrol dan sampel beads kurkumin. Berikut adalah penampakan raw data tersebut (dalam format .htm). Alat MALDI-TOF yang terdapat di kampus saya sudah terintegrasi dengan database peptida protein sehingga saya mendapat raw data yang sudah berbentuk list protein. Raw data yang didapat dari instrumen MALDI-TOF juga dapat dianalisis terpisah menggunakan berbagai software atau website, seperti MASCOT,  ProteinProspector, dan Mass++. Dari raw data eksperimen saya, terdapat 26 protein yang terdeteksi pada sampel control beads dan 53 protein pada sampel kurkumin beads. Lantas, bagaimana analisis selanjutnya?

Screen Shot 2018-04-20 at 19.36.21
Raw data dari sampel control beads

 

 

 

Screen Shot 2018-04-20 at 19.37.00
Raw data dari sampel kurkumin beads

 

 

Screen Shot 2018-04-20 at 19.37.10
Salah satu protein yang terdeteksi pada sampel kurkumin beads adalah carbonyl reductase 1 (CBR1). Data tersebut juga memberikan nilai massa teoretis protein, berapa banyak peptida yang terdeteksi pada sampel dan tingkat kemiripannya dengan database peptida, list peptida yang terdeteksi, serta kemungkinan protein lain yang memiliki kemiripan peptida.

 

Terlihat bahwa baik pada sampel kontrol maupun sampel kurkumin, terdeteksi adanya protein keratin. Kemungkinan yang sangat besar keratin tersebut adalah kontaminan yang berasal dari pelaku eksperimen (saya) dalam melakukan preparasi sampel (walaupun saya sudah melakukan tahap-tahap preventif kontaminasi seperti yang saya jelaskan di atas). Selanjutnya, saya membandingkan protein yang terdeteksi pada sampel kontrol dan sampel kurkumin; untuk kemudian mengidentifikasi protein spesifik yang berikatan dengan kurkumin beads. Hasilnya, saya mendapat 30 kandidat protein yang spesifik berikatan dengan kurkumin beads.

Langkah selanjutnya yang perlu dilakukan terkait dengan list kandidat protein yang didapat dari mass spectrometry adalah verifikasi data. Verifikasi data dapat dilakukan dengan berbagai metode sesuai dengan tujuan penelitian kita. Untuk memverifikasi data mass spectrometry yang saya dapat, saya melakukan pulldown assay dan dilanjutkan dengan western blot.

____________________________________________________________________________________________

Sekian cerita tentang eksperimen identifikasi protein yang saya jalani. Eksperimen ini merupakan eksperimen yang rumit dan menguji kecermatan serta ketelatenan kita sebagai seorang peneliti. Tetapi, hal tersebut akan terbayar ketika kita berhasil mendapat list protein yang minim kontaminasi :).

 

Tambahan bacaan mengenai identifikasi protein dengan MALDI-TOF: 

http://www.iub.edu/~clemmer/Publications/pubs/pub%20084.pdf (penjelasan ringkas tentang MALDI-TOF MS)

https://www.reading.ac.uk/web/files/BioCentre/Sample_preparation_guidelines_for_MALDI_ToF_mass_spectrometry.pdf (Sample preparation guidelines for MALDI ToF mass spectrometry)

 

 

 

cancer · chemoterapy · molecular biology · review

Hallmark of Cancer – How important to know?

Satu sitasi yang pasti dipakai dalam penelitian mengenai kanker adalah Hanahan&Weinberg (2011). Kedua orang ini bisa dibilang selayaknya ‘artis’ dalam dunia per-kanker-an :). Nah paper mereka yang terkenal itu berjudul “Hallmark of Cancer”. Apa sih sebenarnya yang dimaksud dengan Hallmark of Cancer? Hallmark sendiri berarti ‘karakteristik tertentu, yang menarik perhatian’. Pada tahun 2006, Hallmark of Cancer versi Hanahan&Weinberg ada 6 macam, dan pada tahun 2011 ditambah menjadi 10 macam. Berikut adalah Hallmark of Cancer :

Continue reading “Hallmark of Cancer – How important to know?”

molecular biology

Activities of the high-risk HPV E6 and E7 protein (Article Review)

diringkas dari Fehrmann and Laimins (2003) : Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation

protein E6

  • protein E6 harus bekerja bersama dengan E7 untuk menginduksi immortalisasi HFK (primary human keratinocytes)
  • fungsi penting E6
  1. berikatan dengan p53 (tumor supressor protein ) –> degradasi p53 melalui ubiquitinasi
  2. mengaktivasi telomerase
  • fungsi tersebut berkaitan dengan keberlangsungan hidup HPV dalam host. HPV menstimulasi fase S untuk replikasi genom, jika terjadi overekspresi p53 maka siklus sel akan berhenti (arrest) atau terjadi apoptosis dan replikasi genom HPV gagal. Oleh karena itu, p53 didegradasi oleh E6.
  • mekanisme degradasi p53 oleh E6 : protein E6 berikatan dengan ubiquitin-ligase seluler, berupa E6-associated protein (E6-AP) –> kompleks ini berikatan dengan p53 –> E6-AP meng-ubiquitinasi lisin pada p53 –> inisiasi proteolisis oleh proteasom
  • degradasi p53 menyebabkan sel yang mengalami perubahan genetik dapat melewati checkpoint G1/S dan G2/M sehingga dapat menyebabkan transformasi malignan

Protein E7

  • fungsi protein E7 dalam perkembangan kanker berasosiasi dengan anggota famili protein tumor supressor Retinoblastoma (Rb) untuk memfasilitasi progresi ke dalam fase S
  • E7 mengikat Rb ketika fase hiperfosforilasi, mencegah Rb berikatan dengan E2F, sehingga menyebabkan progresi siklus sel
  • pada sel epitel normal, sel yang keluar dari siklus sel akan berdifferensiasi diakibatkan aksi dari Rb. E7 yang berikatan dengan Rb menyebabkan progresi siklus sel pada sel yang berdiferensiasi dan menyebabkan replikasi gen HPV
  • E7 juga dapat mendegradasi Rb melalui ubiquitinasi (kecuali pada tipe HPV-1)
  • E7 juga menghambat aktivitas p21 dan p27 –> mencegah terjadinya cell cycle arrest
molecular biology

HPV Life Cycle

diringkas dari Fehrmann and Laimins (2003) : Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation

  • siklus hidup produktif HPV berhubungan dengan differensiasi sel epitel (fyi, sel serviks yang diinfeksi oleh HPV merupakan sel epitel)

 

  • bagaimana infeksi oleh HPV pada sel terjadi?

adanya microtrauma pada epitelium –> sel basal dimasuki oleh virus –>masuk ke dalam keratinosit –> genom HPV bereplikasi bersama dengan replikasi DNA seluler (replikasi dan maintenance genom HPV berasosiasi dengan ekspresi protein E HPV) –> sel anakan yang terinfeksi meninggalkan lapisan basal, bermigrasi ke daerah suprabasal, dan berdifferensiasi

  • sel yang tidak terinfeksi akan keluar dari siklus sel ketika lepas dari basement membran, sementara sel yang terinfeksi HPV akan masuk ke dalam fase S ketika mencapai lapisan suprabasal. Masuknya sel ke dalam fase S ini menyebabkan amplifikasi genome viral, sintesis E1 dan E4, dan protein capsid. Virus yang terbentuk akan terlepas ke lingkungan ketika lapisan atas epitelium terbuka.

 

  • pada kanker serviks, genom HPV sering ditemukan berintegrasi dengan DNA seluler host. Integrasi ini sering menyebabkan rusaknya protein E2 (yang merupakan inhibitor pengkopian DNA viral), menyebabkan E6 dan E7 terekspresi sangat tinggi dan berkontribusi dalam pembentukan kanker.

 

image

molecular biology

Genom HPV (Review Article)

Diringkas dari Fehrmann and Laimins (2003) : Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation

  • semua tipe HPV memiliki 8 ORF (open reading frame) –> daerah pembacaan DNA yang akan ditranslasi menjadi protein
  • terdapat dua jenis produk gen (berupa protein) : early (E) yang diekspresikan dari early promotor (P97) sebelum replikasi terjadi ; dan late (L) yang diekpresikan dari late promotor (P742) pada saat sintesis virus baru
  • protein yang dihasilkan HPV :
  1. E1 dan E2 : penting untuk replikasi DNA virus dan berikatan sebagai kompleks pada sekuen di sekitar origin replikasi. E2 juga memiliki aktivitas repressor pada promoter virus dan berfungsi sebagai mekanisme kontrol replikasi
  2. E4 : diekspresikan sebagai protein fusi dengan 5 asam amino berasal dari ujung N E1 dan terlibat dalam perubahan jaringan sitoskeleton
  3. E5 : fungsi secara jelas belum diketahui, tetapi sepertinya mengkode protein membran dengan aktivitas transformasi yang rendah
  4. E6 dan E7 : protein transformasi yang utama dan beraksi dengan memodulasi aktivitas protein selular yang mengatur siklus sel.
  5. L1 dan L2 : mengkode protein kapsid

 

image

molecular biology

Apoptosis : Morfologi

Demi mengejar si skr*psi, saya sedikit demi sedikit mulai mendalami mengenai proses apoptosis sel. Dan Alhamdulillah, mendapatkan satu paper yang oke dan lengkap banget reviewnya mengenai apoptosis, dengan judul Apoptosis : A Review of Programmed Cell Death yang ditulis oleh Susan Elmore. Terimakasih untuk Bu Susan yang sudah memberikan pencerahan :”. Untuk lebih mengingat, kali ini saya membuat rangkuman mengenai morfologi sel yang mengalami apoptosis.
Berikut adalah morfologi sel yang mengalami apoptosis :

1. Cell shrinkage/sel menjadi mengkerut
Ukuran sel mengecil, sitoplasma terkondensasi, dan organel-organel menjadi lebih mampat
2. Terjadi pyknosis
Pyknosis adalah kondensasi kromatin
3. Extensive plasma membrane blebbing
Blebbing adalah peristiwa rusaknya sitoskeleton sel dan membuat membrane menjadi menonjol keluar. Jika tonjolan ini memisah akan membentuk badan apoptosis.
4. Karyorrhexis
Fragmentasi nucleus
5. Pembentukan badan apoptosis
Badan apoptosis berisi sitoplasma dan organel-organel dengan atau tanpa fragmen nucleus. Organel-organel di dalamnya masih memiliki integritas yang baik dan dilindungi oleh membrane plasma sehingga sel tidak pecah

Gambar 1. Perubahan morfologi pada sel yang mengalami apoptosis

Badan-badan apoptosis yang terbentuk kemudian segera difagositosis oleh sel fagositik, misalnya makrofag.

Mengapa apoptosis sel tidak menyebabkan inflamasi?
1. Sel yang berapoptosis tidak mengeluarkan komponen selulernya ke jaringan sekitarnya
2. Badan apoptosis langsung dimakan oleh sel fagositik sehingga mencegah nekrosis sekunder
3. Sel yang memakan badan apoptosis tidak memproduksi sitokin pro inflamasi
(Savill and Fadok, 2000; Kurosaka et al., 2003)
Rangkuman lainnya akan diposting di lain waktu 😀

Referensi :
Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495–516.
Kurosaka K, Takahashi M, Watanabe N, Kobayashi Y. Silent cleanup of very early apoptotic cells by macrophages. J Immunol 2003;171:4672-9.
Savill J, Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 2000;407:784–8.