molecular biology · my labwork · publication

Identifikasi Protein dengan MALDI-TOF MS (1)

Beberapa waktu yang lalu, saya dikontak oleh beberapa orang untuk berdiskusi mengenai prosedur identifikasi protein. Saya jadi kepikiran untuk sedikit cerita suka-duka yang saya alami dalam melakukan eksperimen identifikasi protein. Kebetulan, saya sedikit belajar tentang identifikasi protein ketika sekolah S2 dan hasil penelitian tersebut dipublikasikan di sini. Dalam penelitian tersebut, saya meneliti tentang protein yang berinteraksi secara spesifik dengan kurkumin, dengan menggunakan model sel leukemia (chronic myeloid leukemia/CML).

Secara umum, eksperimen identifikasi protein dibagi menjadi 3 tahap, yaitu preparasi sampel, aplikasi sampel ke dalam instrumen, dan analisis data yang dihasilkan oleh instrumen tersebut. Instrumen yang lazim digunakan untuk identifikasi protein adalah mass spectrometry. Terdapat berbagai jenis mass spectometry; dan instrumen yang saya gunakan adalah MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry). Prinsip kerja MALDI-TOF akan saya jabarkan di bawah.

Tahapan eksperimen yang saya lakukan sendiri adalah preparasi sampel dan analisis data, sementara tahap aplikasi sampel ke dalam instrumen MALDI-TOF dilakukan oleh teknisi khusus alat MALDI-TOF di kampus karena pengoperasian alat ini memerlukan skill dan lisensi khusus. Oleh karena itu, saya akan membahas lebih detail bagian preparasi sampel dan analisis data.

  1. Preparasi sampel

Identifikasi protein dengan MALDI-TOF (atau mass-spectometry lainnya) adalah eksperimen yang mahal dan memerlukan effort yang besar. Oleh karena itu, perencanaan eksperimen dan preparasi sampel yang cermat sangat diperlukan sehingga eksperimen memberikan hasil yang memuaskan.

Preparasi sampel yang dilakukan bergantung pada jenis eksperimen dan tujuan data eksperimen tersebut. Karena saya ingin mengetahui interaksi kurkumin dengan protein, maka saya membuat kurkumin beads sebagai bait untuk menarik protein interaktornya dari lisat sel (isolasi protein) dengan metode pulldown assay. Contoh lain, jika kita ingin meneliti interaksi antar protein-protein, maka gunakan salah satu protein sebagai bait-nya. Selain dengan pulldown assay, berbagai metode dapat digunakan untuk mengisolasi protein yang diinginkan, antara lain kromatografi afinitas. Kita juga bisa menggunakan lisat sel keseluruhan (whole cell lysate) sebagai sampel jika ingin mengidentifikasi protein dari suatu sampel sel atau jaringan.

Untitled
Skema kerja isolasi protein yang berinteraksi dengan kurkumin, menggunakan metode pulldown assay

Dua hal mendetail yang tidak banyak dibahas di dalam paper-paper adalah resiko kontaminasi dan pemilihan reagent staining untuk visualisasi protein target. MALDI-TOF dan mass spectrometry lain adalah instrumen-instrumen yang sangat sensitif . Oleh karena itu, besar resiko terjadi kontaminasi dari protein lain ketika kita mengerjakan eksperimen ini. Apa kontaminasi yang terjadi dan dari mana asal kontaminasi tersebut?

Kontaminasi yang sangat mungkin terjadi adalah terdeteksinya protein keratin dalam sampel kita. Suspect terjadinya kontaminasi tersebut adalah diri kita sendiri sebagai pelaku eksperimen karena keratin dapat berasal dari serpihan kulit atau rambut kita. Oleh karena itu, diperlukan kewaspadaan yang tinggi dalam melakukan preparasi sampel untuk identifikasi protein. Tindakan-tindakan yang dapat dilakukan untuk meminimalisir kontaminasi antara lain:

  • Membersihkan peralatan SDS-PAGE dengan baik (merendam peralatan dengan cairan pembersih minimal selama 1 jam, membilas peralatan dengan aquabides sebanyak 2-3 kali, lalu mengeringkan peralatan di dalam oven tanpa adanya peralatan lain)
  • Gunakan 2 lapis sarung tangan selama melakukan eksperimen dan/atau membersihkan peralatan
  • Lakukan eksperimen dengan ringkas dan gerakan seminimal mungkin. Oleh karena itu, penting dilakukan ‘simulasi’ eksperimen untuk mengetahui letak alat, reagen, dan hal lain yang diperlukan. Hal ini akan meminimalisir terjadi gerakan yang tidak perlu ketika eksperimen yang sesungguhnya.

Deteksi awal protein target dilakukan dengan SDS-PAGE dilanjutkan dengan staining gel menggunakan reagent yang sesuai. Pada awal eksperimen (optimasi metode), saya menggunakan metode silver staining untuk visualisasi protein pada gel karena metode ini memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi dengan harga yang relatif terjangkau. Namun, saya tidak dapat menggunakan metode silver staining dalam preparasi sampel untuk instrumen MALDI-TOF karena perlu dilakukan destaining pada gel sebelum sampel dapat diaplikasikan pada instrumen. Perlunya tahap destaining akan memperpanjang eksperimen yang perlu dilakukan dan memperbesar resiko terjadinya kontaminasi protein. Oleh karena itu, saya menggunakan flamingo staining untuk visualisasi gel hasil SDS-PAGE. Kelebihan flamingo staining adalah sifatnya yang kompatibel dengan MALDI-TOF sehingga tidak diperlukan destaining gel sebelum sample diaplikasikan pada instrumen.

Screen Shot 2018-04-20 at 19.30.30
Hasil isolasi protein yang berikatan dengan kurkumin beads dan control beads. Gel yang menunjukkan posisi protein yang diinginkan (<50 kDa) kemudian dipotong dan dianalisis dengan MALDI-TOF MS

Berdasarkan hasil eksperimen SDS-PAGE, saya menemukan bahwa kurkumin berikatan dengan protein-protein dengan ukuran <50 kDa. Oleh karena itu, untuk keperluan analisis MALDI-TOF, saya hanya menganalisis protein dengan ukuran <50 kDA dengan cara memotong gel hasil SDS-PAGE tersebut pada ukuran <50 kDa. Saya juga membandingkan protein yang berikatan pada control beads (beads yang tidak dikopling dengan kurkumin) vs protein yang berikatan pada kurkumin beads untuk mengeliminasi false positive pada hasil analisis MALDI-TOF.

___________________________________________________________________________________________

bersambung ke bagian dua di sini.

 

 

Advertisements
molecular biology · my labwork · publication

Identifikasi Protein dengan MALDI-TOF MS (2)

Baca tahapan eksperimen sebelumnya di sini.

  1. Aplikasi sampel ke dalam instrumen (MALDI TOF)

Tahap eksperimen ini tidak saya lakukan sendiri sehingga saya akan menceritakan secara sederhana prinsip kerja instrumen MALDI-TOF MS. Sampel yang sudah didapat dari tahap sebelumnya (tahap 1) dicampurkan dengan matriks dan kemudian diaplikasikan pada instrumen. Dalam eksperimen saya, sampel protein didigesti terlebih dulu dengan enzim tripsin dan peptida-peptida protein yang terbentuk dicampur dengan matriks. Digesti protein menjadi peptida penting dilakukan karena MALDI-TOF dapat mendeteksi molekul dengan baik pada rentang ukuran 600 Da-3500 Da (0.6 kDa-3.5 kDa). Penjelasan lebih lanjut mengenai matriks MALDI-TOF dapat dibaca di sini.

Sampel dan matriks kemudian ditembak dengan laser dan radiasi laser tersebut akan ‘menguapkan’ dan memberi muatan elektronik pada matriks+sampel hingga menjadi ion, yang kemudian ion tersebut bergerak menuju ke detektor. Besarnya muatan elektronik ion akan memisahkan ion satu dengan yang lain (berdasarkan rasio m/z+ atau rasio massa/muatan elektronik) sehingga akan terbentuk spektra massa yang kemudian dideteksi oleh detektor.

 

malditof
Prinsip kerja instrumen MALDI-TOF MS (sumber)

 

  1. Analisis data

Setelah sampel selesai dianalisis dengan alat MALDI-TOF, saya mendapat raw data dari sampel beads kontrol dan sampel beads kurkumin. Berikut adalah penampakan raw data tersebut (dalam format .htm). Alat MALDI-TOF yang terdapat di kampus saya sudah terintegrasi dengan database peptida protein sehingga saya mendapat raw data yang sudah berbentuk list protein. Raw data yang didapat dari instrumen MALDI-TOF juga dapat dianalisis terpisah menggunakan berbagai software atau website, seperti MASCOT,  ProteinProspector, dan Mass++. Dari raw data eksperimen saya, terdapat 26 protein yang terdeteksi pada sampel control beads dan 53 protein pada sampel kurkumin beads. Lantas, bagaimana analisis selanjutnya?

Screen Shot 2018-04-20 at 19.36.21
Raw data dari sampel control beads

 

 

 

Screen Shot 2018-04-20 at 19.37.00
Raw data dari sampel kurkumin beads

 

 

Screen Shot 2018-04-20 at 19.37.10
Salah satu protein yang terdeteksi pada sampel kurkumin beads adalah carbonyl reductase 1 (CBR1). Data tersebut juga memberikan nilai massa teoretis protein, berapa banyak peptida yang terdeteksi pada sampel dan tingkat kemiripannya dengan database peptida, list peptida yang terdeteksi, serta kemungkinan protein lain yang memiliki kemiripan peptida.

 

Terlihat bahwa baik pada sampel kontrol maupun sampel kurkumin, terdeteksi adanya protein keratin. Kemungkinan yang sangat besar keratin tersebut adalah kontaminan yang berasal dari pelaku eksperimen (saya) dalam melakukan preparasi sampel (walaupun saya sudah melakukan tahap-tahap preventif kontaminasi seperti yang saya jelaskan di atas). Selanjutnya, saya membandingkan protein yang terdeteksi pada sampel kontrol dan sampel kurkumin; untuk kemudian mengidentifikasi protein spesifik yang berikatan dengan kurkumin beads. Hasilnya, saya mendapat 30 kandidat protein yang spesifik berikatan dengan kurkumin beads.

Langkah selanjutnya yang perlu dilakukan terkait dengan list kandidat protein yang didapat dari mass spectrometry adalah verifikasi data. Verifikasi data dapat dilakukan dengan berbagai metode sesuai dengan tujuan penelitian kita. Untuk memverifikasi data mass spectrometry yang saya dapat, saya melakukan pulldown assay dan dilanjutkan dengan western blot.

____________________________________________________________________________________________

Sekian cerita tentang eksperimen identifikasi protein yang saya jalani. Eksperimen ini merupakan eksperimen yang rumit dan menguji kecermatan serta ketelatenan kita sebagai seorang peneliti. Tetapi, hal tersebut akan terbayar ketika kita berhasil mendapat list protein yang minim kontaminasi :).

 

Tambahan bacaan mengenai identifikasi protein dengan MALDI-TOF: 

http://www.iub.edu/~clemmer/Publications/pubs/pub%20084.pdf (penjelasan ringkas tentang MALDI-TOF MS)

https://www.reading.ac.uk/web/files/BioCentre/Sample_preparation_guidelines_for_MALDI_ToF_mass_spectrometry.pdf (Sample preparation guidelines for MALDI ToF mass spectrometry)

 

 

 

conference · my labwork

Joint The 72nd Annual Meeting of Japanese Cancer Association

Ini sedikit cerita yang tertunda setelah satu bulan hehe ^^v

Tanggal 2 Oktober yang lalu, pertama kali saya merasakan atmosfer internasional yang benar-benar internasional. Berangkat ke Jepang untuk mengikuti The 72nd Annual Meeting of Japanese Cancer Association. Acara tahunan pakar-pakar kanker di Jepang ini diadakan di Pacifico Yokohama Convention Center, tanggal 3-5 Oktober 2013. Dengan tema “Cancer Research Providing Hope to Fight Against Cancer”, konferensi ini kabarnya berhasil menarik lebih dari 5000 partisipan dan lebih dari 1000 oral maupun poster presentation dari seluruh dunia, Wow!

Continue reading “Joint The 72nd Annual Meeting of Japanese Cancer Association”

my labwork

MTT assay

Apa itu MTT assay?

MTT assay merupakan metode yang jamak digunakan dalam penelitian mengenai agen antikanker. Metode ini digunakan untuk menguji aktivitas sitotoksik sampel penelitian pada kultur sel yang digunakan.

Bagaimana prinsip MTT assay?

Prinsip metode ini adalah reaksi redoks yang terjadi di dalam sel. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) direduksi menjadi garam formazan oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di dalam mitokondria sel hidup. Reaksi dibiarkan terjadi selama 4 jam kemudian ditambahkan reagen stopper. Reagen stopper tersebut akan melisis membran sel sehingga garam formazan dapat keluar dari sel, serta melarutkan garam formazan tersebut. Garam formazan yang terbentuk dikuantifikasi dengan spektrofotometer dan diukur dalam bentuk absorbansi. Semakin tinggi absorbansi, semakin banyak sel yang hidup (viabilitas sel tinggi)

Continue reading “MTT assay”

my labwork

Sedikit belajar statistic penelitian in vivo (KOLMOGOROV SMIRNOV – ANOVA – TUKEY)

Alhamdulillah, pada program pkm kemarin, tim saya mendapatkan grant untuk melakukan penelitian in vivo, yaitu penelitian menggunakan hewan uji. Kami meneliti mengenai potensi ekstrak kulit jeruk purut (C. hystrix) sebagai agen kardio-hepatoprotektif pada tikus yang diberi obat kemoterapi doxorubicin. Tentu kalian sudah pernah mendengar bahwa obat kemoterapi menimbulkan berbagai efek samping, salah satunya adalah kerusakan jantung dan juga hepar, yang dapat menyebabkan kematian. Nah lho, orang ingin sembuh dari kanker, tapi efek sampingnya sebesar itu? Oleh karena itu, kami meneliti mengenai efek kulit jeruk purut sebagai pelindung hepar dan jantung dari pengaruh kemoterapi, walaupun penelitian ini masihlah penelitian pendahuluan J. Oke, cukup pengantar tentang penelitiannya hehe. Saya hingga saat ini lebih banyak belajar di in vitro dibandingkan dengan in vivo. Menurut saya, pengolahan data pada in vivo lebih rumit dan mempertimbangkan banyak faktor dibandingkan in vitro. Sedikit saya mengulas mengenai simulasi metode statistika yang tim kami gunakan untuk mengolah penelitian ini pada post saya kali ini.

Pada penelitian ini, kami mendapatkan data ALT dan AST, suatu enzim yang akan naik kadarnya dalam darah jika terjadi kerusakan hepar. Kami menggunakan 5 kelompok tikus, masing-masing 5 tikus sebagai data kami. Tapi, pada kenyataannya ada tikus yang mati juga. Berikut adalah pengelompokkan tikus :

1 : kontrol doxorubicin

2 : doxorubicin + EJP 500mg/kgBB

3 : doxorubicin + EJP 1000mg/kgBB

4 : control EJP

5 : control tanpa perlakuan

Berikut adalah data yang kami dapatkan

Kel         AST        ALT

1.0          180.1     56.3

1.0          183.4     70.0

1.0          183.7     60.0

1.0          179.8     56.1

1.0          181.2     53.1

2.0          179.8     45.3

2.0          181.9     46.5

2.0          175.3     47.9

2.0          176.4     48.0

2.0          177.1     47.3

3.0          145.5     43.4

3.0          146.7     43.0

3.0          147.5     42.3

3.0          141.5     44.5

4.0          100.5     20.3

4.0          100.2     21.6

4.0          99.6        17.5

4.0          98.7        18.4

5.0          102.3     15.6

5.0          103.4     16.0

5.0          104.3     15.9

5.0          101.2     15.75

5.0          100.4     15.7

*perhatikan pada kelompok 3 dan 4 hanya ada 4 tikus

Ini adalah jalur umum analisis statistic

Sumber : Modul statistika, Departemen LKPM BEM KMFA 2010

Langkah yang dilakukan :

  1. Buka SPSS (kami menggunakan versi 16.0)
  2. Masuk ke variabel view, masukkan data-data sesuai kolom (lihat contoh),
  3. tampilan variable view
 
   
  1. tampilan value
  2. Pada value perlakuan, masukkan data kelompok-kelompok perlakuan, masukkan nomor kelompok ke value dan deskripsi kelompok ke labelBuka data view, masukkan data penelitian

    tampilan data view
  3. Dalam statistic, dikenal  distribusi data normal dan tidak normal untuk menentukan jenis uji yang akan dilakukan, parametric atau non parametric (lihat bagan uji statistic sebelumnya). Untuk itu, digunakan uji kolmogorov smirnov

Cara :

Klik : analyze –> non parametric test –> 1-sample K S

Akan muncul kotak dialog seperti ini

                Masukkan parameter penelitian ke dalam kotak test variable list, klik options –> descriptive –> ok, klik ok pada kotak dialog ini, muncul output :


1. Jika probabilitas > 0,05; maka H0 diterima; maka distribusi sampel normal,Perumusan kesimpulan dari tes KS dengan tarafkepercayan 95% :

2. Jika probabilitas < 0,05; maka H0 ditolak; maka distribusi sampel tidak normal.

Atau lihat pada hasil output, sudah ditampilan bahwa distribusi data normal 🙂

Karena sudah mengetahui bahwa distribusi data normal, maka kami melanjutkan uji menggunakan statistika parametrik untuk mengetahui apakah ada perbedaan signifikan pada 5 kelompok perlakuan tersebut. Uji yang kami pilih adalah ANOVA ONE WAY karena terdapat lebih dari dua kelompok yang akan dibandingkan dengan menggunakan satu variabel (ALT/AST). Berikut adalah langkah-langkahnya

Pilih post hoc test HSD tuckey. Prosedur pengujiannya mirip dengan LSD, yaitu mempunyai satu pembanding dan digunakan sebagai alternatif pengganti LSD apabila kita ingin menguji seluruh pasangan rata-rata perlakuan tanpa rencana. Test ini yang paling powerfull untuk membedakan mean antar kelompok.

Hasil anova menunjukkan signifikansi 0.000 (< 0.05) yang berarti ada perbedaan signifikan di antara kelima kelompok.

 

Hasil tukey HSD ALT

Hasil ANOVA kadar AST

INTERPRETASI

Kadar ALT

Tidak ada perbedaan signifikan antara kelompok 1 dengan 5 –> pemberian doxorubicin tidak meningkatkan kadar ALT secara signifikan

Ada perbedaan signifikan antara kelompok 1 dengan 2, tidak dengan 3 –> pemberian EJP menurunkan kadar ALT signifikan disbanding dengan hanya diberi doxo, tapi efeknya tidak meningkat seiring pemberian dosis tinggi

Ada perbedaan signifikan antara kelompok 4 dan 5 –> pemberian EJP menurunkan kadar ALT dibanding control

Kadar AST

Tidak ada perbedaan signifikan antara kelompok 1 dengan 5 –> pemberian doxorubicin tidak meningkatkan kadar AST secara signifikan

Ada perbedaan signifikan antara kelompok 4 dan 5 –> pemberian EJP menurunkan kadar AST dibanding control

Perlu diingat, interpretasi hasil data ini sangatlah penting, oleh karena itu harus selalu dikonsultasikan dengan dosen pembimbing. Karena, jika salah interpretasi, kesimpulan yang ditarik pun akan salah. Mohon maaf jika contohnya kurang lengkap, ini baru berdasar pengalaman kemaren aja hehe. Semoga bisa mencoba uji-uji yang lain lagi nanti, dengan contoh yang relevan juga 🙂